کاریوتیپ چیست وچگونه تهیه می شود؟

یکی از دقیقترین روشهای شناسایی نمونه ها در بسیاری ازگونه ها استفاده از تکنیکهای سیتوژنتیک است و مطالعات ژنوتیپی از اصیل ترین مطالعات محسوب می شود چرا که آنچه در ظاهر نمونه بروز می کند (فنوتیپ) انعکاسی از ساختار ژنتیکی (ژنوتیپ) آن است ، هر چند در طی طریق از ژنوتیپ به فنوتیپ عوامل واسطه و تاثیر گذار متعددی همچون تاثیرات محیطی نقش آفرینی می کنند و سبب تغییراتی سوای آنچه از فنوتیپ انتظار می رفت می گردند.
بنابراین حذف عوامل واسطه و رسیدن به سر منشأ آنچه سبب تغییرات ذاتی در نمونه ها می شود از اصالت خاصی برخوردار بوده و در مطالعات بنیادین توصیه می شود. تهیه کاریوتایپ و مطالعات کاریولوژیکی همانند شمارش تعداد ، شکل و اندازه کروموزومها روشنگر تفاوتهای اصیل در نمونه ها است ، هر چند اندازه کروموزومها از اهمیت کمتری برخوردار بوده ولی نسبت بازوهای کروموزومی می تواند جایگزین آن شود.
در این طرح پژوهشی ، مطالعات سیتوژنیتیکی بر روی سوسماران مشهد صورت گرفته و کاریوتایپ آنها تعیین شده است.
بدین لحاظ اکثر نمونه های صید شده مورد مطالعه سیتوژنتیکی قرار گرفتند بطوریکه در گونه های Trapelus و Eremias کاریوتایپ بیش ار ۹۰% نمونه ها و در گونه های Laudakia و Mabuya کاریوتایپ بیش از ۶۰% نمونه ها تهیه گردید. جهت تهیه کاریوتایپ ضرورت داشت نمونه ها بصورت زنده به آزمایشگاه منتقل و تا هنگام کار زنده می ماندند. متابولیسم پائین خزندگان نسبت به رده های عالیتر همچون پستانداران از موانع جدی تهیه کاریوتایپهای مناسب بود و در اسارت نگهداشتن نمونه ها و عدم تغذیه آنها در طی دوره نگهداری در آزمایشگاه متابولیسم راباز هم پائین تر آورده و مشکلات کاری را مضاعف می نمود. مخمر آبجو از ترکیباتی است که تقسیمات سلولی را افزایش می دهد.
بدین لحاظ بمنظور تسریع در روند تقسیم سلولی ۱۲ تا ۲۴ ساعت قبل از انجام کار به نمونه مخمر آبجو تزریق گردید. تزریق بصورت داخل سلومی و با سرنگ انسولین انجام گرفت. میزان تزریق مناسب بر اساس وزن جانور تعیین و به ازاء هر گرم وزن جانور ۲% مخمر آبجو تزریق گردید. در طی ۱۲ تا ۲۴ ساعت مخمر آبجو اثر خود را گذاشته و باعث افزایش تعداد سلولهای درحال تقسیم می گردد. مرحله بعدی ایجاد اختلال در مراحل تقسیم سلولی است . بهترین زمان در چرخه تقسیم سلولی برای مطالعه کروموزومها مرحله متافاز تقسیم میتوز است بنابراین اگر تقسیمات سلولی در این مرحله متوقف شود کروموزومها به فرم کاملاً متراکم و مشخص در آمده اند. کلشی سین یا سولفات وین بلاستین از ترکیباتی است که تقسیم میتوز را در مرحله متافاز متوقف می کند. بنابراین از این ترکیبات استفاده گردید.
تزریق کلشی سین نیز بصورت داخل سلومی با سرنگ انسولین انجام گرفت و میزان آن بر اساس وزن جانور تعیین گردید. بهترین میزان تزریق ۱% به ازاء هر گرم وزن جانور است. زمان تاثیر گذاری کلشی سین ۱ تا ۵/۱ ساعت است. پس از این مرحله نوبت استخراج سلولهای مناسب است. از سلولهای مختلفی میتوان جهت تهیه کاریوتایپ استفاده کرد. در انسان از سلولهای خونی بویژه لنفوسیتها استفاده می گردد ولی در جانوران خرد جثه بیشتر از مغز استخوان استفاده می شود که مرکز خون سازی است . در تهیه کاریوتایپ سوسماران نیز از مغز استخوان استفاده شد لذا پس از بیهوش کردن نمونه با کلروفورم ، جانور تشریح و یکی ازاستخوانهای ران آن از پا جدا می شد.
جداسازی استخوان ران بنحوی انجام می گرفت که حداقل آسیب را به آناتومی جانور وارد سازد بنابراین استخوان از لابلای عضلات خارج و آنگاه از محل اتصال باکمر بند لگنی آزاد و جدا می شد. عضلات و سایر قسمتهای اندام حرکتی به تنه متصل مانده و سپس جهت نگهداری دائمی نمونه ها دربخشهای مختلف جانور فیکساتور فرمالین ۶% تزریق میگردید. این تزریق از درون دهان و کلواک جهت تثبیت دستگاه گوارش ، از ناحیه شکمی جهت تثبیت اندامهای داخلی ، درون دستها و پاها و دم جهت تثبیت عضلات و... انجام می گرفت و نمونه ها پس از فرم گیری با دستگاه دایموند شماره گذاری و به جمع نمونه های کلکسیون سوسماران موزه جانور شناسی دانشکده علوم دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد افزوده می گشت.
پس از جداسازی ران ، طرفین استخوان برش خورده و محتویات آن استخراج می گردید که مملو از سلولهای خونی ساخته شده در مغز استخوان بود.
مرحله بعدی نازک کردن غشاء این سلولها بود تا عمل آزادسازی ژنوم سلول راحت تر انجام گیرد. این فرایند بکمک محلول KCl انجام پذیرفت. بدین لحاظ سلولهای جداشده از مغز استخوان در محلول KCl قرار گرفته و بمدت چند دقیقه در انکوباتور با دمای حدود ۳۵ نگهداری می شد. سپس جهت خالص سازی سلولهای مورد نیاز از سایر عوامل از جمله چربیها و... محلول سانتریفوژ می گردید. این عمل طی ۳ مرحله بمدت ۱۰ دقیقه و با سرعت ۱۰۰۰ دور در دقیقه انجام می گرفت.
در هر مرحله به رسوب ایجاد شده از سانتریفوژ مقداری محلول فیکساتور که ترکیبی از متانول و اسید استیک گلاسیال به میزان ۳ به ۱ بود افزوده و عمل سانتریفوژ تکرار می گردید و محلول رویی لوله سانتریفوژ دور ریخته می شد. در آخرین مرحله سانتریفوژ به رسوب باقیمانده حدود ۵/۰ فیکساتور افزوده شده و پس از همگن کردن رسوب ، محلول حاصله را از ارتفاع حدود ۵۰ سانتیمتری بر روی لام میکروسکوپی پرتاب می کردیم. هدف از این کار پاره شدن غشاء نازک شده و آزاد سازی کروموزومها و پخش شدن آنها بر روی لام بود. آنگاه محتویات روی لام توسط شعله ملایم ثابت و نهایتاً توسط گیمسای ۱۵% رنگ آمیزی می گردید. مرحله آخر پیدا کردن کاریوتایپ مناسب بر روی لام ، عکسبرداری از آن و نهایتاً مطالعه و تکمیل جدول آنالیز کروموزومی نمونه ها بود که در ادامه مورد بحث قرار می گیرد.
شمارش کروموزومها ، تعیین وضعیت آنها از نظر محل استقرار سانترومر ، اندازه گیری طول آنها و یافتن همولوگها و... از کارهای مرسوم در مطالعات کاریولوژیکی است.
شمارش کروموزومهای نمونه ها بر اساس عکسهای تهیه شده از کاریوتایپ آنها انجام و عدد کروموزومی آنها بدست می آمد. در رابطه با محل استقرار سانترومر ، کروموزومها را میتوان به چهار گروه متاسانتریک ، ساب متاسانتریک ، ساب تلوسانتریک و تلوسانتریک (اکروسانتریک) تقسیم کرد . معیار این تقسیم بندی نسبت بازوهای بزرگ و کوچک کروموزومها به یکدیگر میباشد. جدول نحوه این تقسیم بندی را نشان می دهد .

● خصوصیات مورفولوژیک کروموزوم
تشخیص و تعیین کروموزومهای همولوگ بر اساس اندازه کلی کروموزوم و نوع آن انجام می گیرد و سایر نتیجه گیریها بر اساس ترسیم ایدیوگرام مربوطه قابل حصول است . ایدیوگرام در حقیقت ترسیمی الهام گرفته از کاریوتایپ حقیقی است با این تفاوت که در آن اصلاحاتی (همچون رفع کج شدگیهای کروموزومها) انجام شده است . این ترسیم از جهات بسیاری مطالعه را دقیق تر و راحت تر می نماید. ایدیوگرامها طوری ترسیم شده اند تا مواردی همچون طول بازوهای کروموزومی و درصد طول هر کروموزوم نسبت به طول کل کروموزوم ها قابل تشخیص باشد.

/ 2 نظر / 15 بازدید
صورتی

سلام. شما هم از وبلاگ من دیدن کنید خوشحال می شم.

عنبر

[دست] عالی بود. مختصر و مفید